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            了解這些知識,養好細胞不是事兒!

            2022-06-21 14:24 作者:安桐 來源:上海遠慕生物試劑
            抗體藥物是目前生物技術藥物研究中最為活躍的領域,特別是在腫瘤和自身免疫性疾病等方面的臨床應用,更是大放異彩。隨著臨床需求的增加,單克隆抗體藥物發展迅速,FDA已批準的抗體藥物多達70多個,抗體藥物銷售量年增長率基本在10%以上,大大高于制藥行業平均水平,其市場規模已經達到千億美元。

            我國針對單克隆抗體藥物的研究與開發也是如火如荼,行業內競爭異常激烈。據統計我國生物類似藥研發占全球在研類似藥總數的36%。目前,我國約有600家企業在抗體藥物領域布局,約有200家企業已提交抗體藥物臨床試驗申請,且靶點比較集中,以TNF-α、EGFR、VEGF、HER2為主。

            高速增長的抗體藥物正在改變包括癌癥在內的多種疑難疾病的治療觀念,因此如何提高哺乳動物細胞生產治療性抗體的產量和質量便越來越受到重視。
            細胞培養是單克隆抗體藥物生產的關鍵環節,直接影響到單抗的產量和質量。細胞培養過程的不穩定,一方面使得不同批次細胞培養的最終抗體產量和質量不一致,影響抗體藥物的安全性;另一方面,增加細胞培養過程失敗的可能性,產生巨大的資源浪費,降低企業生產的經濟效益。

            用于分泌單克隆抗體的哺乳動物細胞培養條件比較苛刻,細胞外環境的變化容易對抗體的結構產生直接的影響,進而影響單抗藥物的有效性和安全性。因此,比較理想的細胞培養體系需滿足以下幾個條件:1、高產率、低成本的細胞系;2、能夠得到較高產量和合格質量的培養基和培養罐條件;3、適于過程控制的在線或離線分析技術;4、對不同規模的細胞培養過程有充分的理解,保證規模放大的效果。

            在用于單克隆抗體藥物生產的細胞培養過程中,影響抗體生產的穩定性主要是以下幾個方面:在工藝參數優化過程中,對細胞培養過程各個參數控制仍存在不足,難以保證過程性能一致性;對不同規模細胞培養過程中,不同規模的培養條件也有所區別,難以實現規模放大。針對細胞培養生產單克隆抗體中存在的難題,引入新的研究思路,增加細胞培養過程的理解,優化生產工藝,提高單抗藥物的產率,保證批次間和不同規模下過程性能的一致,降低生產成本,已成為提高生產企業競爭力的重要途徑。

            細胞培養過程中主要性能參數

            在細胞培養過程中,通常將活細胞密度(viable cell density,VCD)、細胞活率(viability)、細胞單位生產率(specific productviy,Qp)、糖基化等內容作為細胞培養過程中的性能指標。

            活細胞密度是指細胞生長過程中某個時間點內單位體積內活細胞的數目,也可以直接以活細胞數目(viable cell,VC)表達,通過比較不同時間點的活細胞密度了解培養罐中細胞的生長和增殖情況,對單抗生產至關重要。

            細胞活率是某個時間點培養罐的單位體積內活細胞數目占所有細胞數目的比例。在細胞培養的前期,細胞活率普遍較高,隨著細胞凋亡期的到來,細胞活率逐漸降低,合適的環境和培養方式能夠使細胞在培養后期保持相對較高的活率。通過流加培養結合培養基優化的方式,提高了細胞培養后期的細胞活率,使細胞培養過程中細胞活率均保持在80%以上,實現了CHO細胞目標蛋白產率的最大化。上述細胞密度及活率的檢測中可以使用貝克曼Vi-CELL XR細胞計數和活率檢測系統,在細胞培養工藝監測過程中,確??贵w關鍵質量屬性及表達量、胞密度、活性等主要指標的穩定性,有效的解決了過程中細胞參數的測定。Vi-CELL XR的優勢在于,全自動測量,樣品不需要前處理,完全解放了人力,測試分析時間快,準確度高,真正為細胞培養過程的調整提供了保障。

            細胞單位生產率(specific productviy,Qp)是指單位細胞單位時間內抗體蛋白的產量,該指標通常在選擇細胞系時使用。

            在提高抗體生產的穩定性中,以上指標是細胞培養工藝優化的主要目標。而活細胞密度、細胞活率和細胞單位生產率等都對單抗的終產量有很大的影響。

            細胞培養過程中的主要影響因素

            在細胞培養過程中,除了含有表達載體的宿主細胞和培養基外,培養方式、培養工藝參數、代謝物、理化環境和培養規模等因素都會對過程性能參數產生影響。

            2.1 工藝參數的影響

            當宿主細胞和培養基確定后,我們需要在實驗室進行小試規模細胞培養工藝參數的摸索與優化,為細胞培養過程放大提供合適的大規模培養條件,保證放大后的大規模細胞培養過程有較好的一致性。通常,細胞培養工藝參數有溫度、pH值、溶氧(dissolved oxygen,DO值)、二氧化碳分壓(pCO2)和攪拌速率等。

            細胞培養液的初始pH值由培養基中的緩沖鹽決定,在細胞培養過程中,pH值容易受到乳酸和NH4+等因素的影響。當pH值超出設定的范圍時,通過往培養體系中補加CO2或加入NaHCO3溶液的方式將pH值控制在設定范圍。pH值對細胞的生長、代謝、重組蛋白的產出和糖基化都有顯著的影響。

            溶氧一般選擇在20%-50%的范圍內,這樣既能保證細胞正常代謝所需,又可以減少因糖酵解受到抑制而產生乳酸,也可以避免因溶氧過高導致對細胞的毒性。有研究發現,50%的溶氧與其它溶氧水平相比,細胞的生長速率沒有顯著差異,但是過低和過高的溶氧環境中,促紅細胞生成素的產率明顯低于10%-100%的溶氧環境。相關研究還表明,溶氧對于細胞的代謝、重組蛋白的合成和糖基化修飾也有一定的影響。

            細胞培養液中溶解的CO2同樣會影響過程性能參數。研究表明,當細胞培養液中的pCO2大于150mmHg時,細胞的生長就會受到抑制,而且抗體蛋白的產量也會降低。因此,細胞生長過程中產生的CO2需要及時排出,尤其是大規模的細胞培養過程中,要注意減少CO2積累對細胞生長所產生的影響。

            溫度也是細胞培養過程的關鍵工藝參數之一,它對細胞的生長、抗體蛋白的產量和質量具有顯著的影響。較低的培養溫度有利于提高細胞的單位生產率,減緩細胞的代謝,抑制細胞的生長,維持細胞較高的活率,提高目標蛋白的質量。研究發現,在細胞生長接近穩定期時降低培養溫度,可以降低抗體蛋白中N-羥乙酰神經氨酸的含量。

            2.2 細胞培養過程中理化參數的影響

            細胞所處的理化環境往往隨著培養時間的變化而變化,它們對細胞的生長和抗體蛋白的合成具有極其重要的影響。常見的理化環境參數,除了工藝參數設置的pH值和pCO2外,還包括NH4+濃度、Na+濃度、K+濃度和滲透壓(Osmolality,Osm)。有研究發現,當培養體系中NH4Cl的濃度大于5mM時,細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗增加,丙氨酸、甘氨酸和谷氨酸的合成增多,這種情況下細胞活率會受到抑制,其結果是細胞培養前期的抗體蛋白產率增加,抗體蛋白的糖基化受到影響。細胞膜內外的Na+和K+濃度與跨膜轉運、能量代謝等作用密切相關,在細胞的生長、蛋白的合成分泌中發揮著重要的作用。高滲透壓能夠對細胞生長產生抑制,pCO2會影響細胞的代謝,并最終影響抗體蛋白的產率。上述理化參數可以使用生化分析儀取樣離線檢測,對這些參數的分析有助于增加細胞培養過程性能參數的監測。

            2.3 細胞培養過程中代謝產物的影響

            細胞所處的外環境不僅包括培養基和外界控制的理化條件,也包括細胞自身代謝物所形成的環境。常見的細胞代謝物主要分為營養成分和代謝中間產物,它們對細胞的生長、增殖和抗體蛋白的分泌有重要影響。對于細胞培養過程中代謝物的研究,有助于了解細胞不同培養時期的代謝狀態。

            現階段的細胞培養都使用無血清成分的CD培養基,無血清培養基成分相對明確,一般含有葡萄糖、氨基酸、維生素、脂質、核苷和生長因子等營養成分。葡萄糖是細胞培養過程中常見的碳源,而谷氨酰胺和天冬酰胺是細胞生長的氮源。在細胞培養過程中,需要對葡萄糖和谷氨酰胺的濃度進行監測,減少因細胞營養成分不足引起的細胞生長障礙。葡萄糖通過糖酵解代謝生成乳酸,葡萄糖的消耗同時也是乳酸積累的過程,乳酸直接影響pH值,并影響細胞的代謝,乳酸在穩定期的生成速率會有所降低。細胞培養過程中,通過流加葡萄糖和半乳糖同樣可以提高細胞密度和抗體蛋白的產率。

            氨基酸是蛋白質組成的基本單位,對細胞的生長和蛋白的合成有著重要的影響。采用不同的細胞系或是改變細胞培養的工藝參數,各氨基酸的代謝能力也隨之變化。針對消耗較快的氨基酸,給予適時的補給,有利于保證細胞的正常生長和提高目標蛋白的產率。有實驗通過增加培養基中含量有限的蛋氨酸、色氨酸、天冬酰胺和絲氨酸,減少過多的丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸的方式,不僅獲得了更高的活細胞密度,同時提高了目標蛋白的產量。維生素對于維持細胞的正常生理狀態起著不可替代的作用,它是形成酶的輔基或輔酶的重要原料。在培養基中加入不同類別的維生素,可以提高活細胞密度,同時增加部分氨基酸的含量,能夠顯著提高抗體蛋白的產量。

            蘋果酸、酮戊二酸和延胡索酸等是細胞三羧酸循環(TCA)的中間產物,這些三羧酸中間產物隨著細胞培養時間的增加,它們在培養基中的濃度逐漸增加。研究發現,乳酸代謝的變化會影響TCA循環的進行,進而影響細胞ATP的供應,這些代謝活動的改變使過程性能參數產生了顯著的差異。核苷類成分是細胞生長增殖的主要原料,次黃嘌呤和胸腺嘧啶在培養初期加入培養基能夠剌激細胞的生長速度,提高單克隆抗體的產量。監測這些代謝物在細胞培養工藝參數改變時的變化特征,揭示它們與過程性能參數之間的聯系有利于實現過程的調控,保證細胞培養過程的一致性。

            2.4 細胞培養規模的影響

            在小試規模完成工藝參數優化后,通常需要工藝放大至中試規?;蛏a規模,以獲得臨床前單抗、臨床研究單抗及商業化生產單抗等進行后續研究或銷售。在工藝放大過程中,需要確保產品產量及關鍵質量屬性不會發生顯著變化。所以大規模細胞培養的困難在于氧傳遞的限制、副產物的累積、細胞對剪切力的反應以及更為完善的過程控制等。研究表明,在2000L的細胞培養體系里,pH和溶氧會呈梯度變化。因此,在大規模細胞培養的研究中,需要重點關注氧傳遞、pH變化和CO2的去除等培養條件的優化。

            有科學家利用代謝組學發現不同的培養規模下,細胞的代謝活動是存在差異的。因此,有理由認為不同培養規模下,細胞培養的理化條件和代謝活動是存在差異的。而了解不同規模下與過程性能參數相關的理化條件差異、代謝差異,有助于細胞大規模培養的成功,保證抗體蛋白產量及關鍵質量屬性的一致性。

            以往的研究主要采用單因素數據分析法來比較不同規模細胞培養過程中常見理化條件參數、代謝指標與過程性能的相關性。但是,在細胞培養過程中,理化條件和代謝活動之間是相互影響的,理化環境的改變會引起細胞代謝的變化,細胞代謝的變化同樣對理化環境產生影響,并最終影響過程性能。因而,需要整合細胞培養過程中采集的理化環境參數、代謝物含量和過程性能數據,對不同規模下這三者之間的關系進行研究與比較,增加對細胞培養放大過程的理解,為細胞培養過程控制策略的開發提供參考。

            目前,很少有針對大規模細胞培養生產抗體過程產量穩定的報道,而保證細胞培養不同批次間抗體產量的穩定,不僅能夠保證實驗數據的可靠性與可重復性,而且能夠滿足抗體生產過程對工藝穩定性的要求,對于保證藥品生產的安全性及企業的經濟效益具有重要作用。
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